Moléculas a reacción

Blog de divulgación del Instituto de Síntesis Química y Catálisis Homogénea

Nobel de Química de 2017: Criomicroscopia electrónica

José Ignacio García Laureiro, ISQCH

Hace unos días se anunció el premio Nobel de Química 2017, que fue a recaer sobre los investigadores Jacques Dubochet (Lausana), Joachim Frank (Columbia) y Richard Henderson (Cambridge). El motivo del premio fue “el desarrollo de la criomicroscopia electrónica para la determinación de la estructura de biomoléculas en solución a gran resolución”. Como de costumbre, a los legos en la materia, esta justificación nos deja más bien “fríos” (nunca mejor dicho 😉 ), así que vamos a intentar analizar esta técnica y su importancia en el presente post.

NoChem

De izquierda a derecha: Jacques Dubochet, Joachim Frank y Richard Henderson

Hay muchas palabras clave en este premio: Crio, Microscopia Electrónica, Biomoléculas, Solución y Gran Resolución. Lo mejor es ir introduciéndolas en su contexto, mientras vamos desentrañando el ovillo.

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA: ¿POR QUÉ ELECTRONES?

El principio fundamental de cualquier microscopia es que para ver un objeto con detalle se necesita iluminarlo con una luz de menor longitud de onda que el objeto estudiado. Imaginemos que la longitud de onda es equivalente al tamaño de un píxel en una imagen. Si el píxel tiene el tamaño de la imagen completa, solo tendremos un cuadrado de un color: ¡imposible saber nada acerca de la imagen! Conforme el tamaño de cada píxel se va haciendo menor, la imagen va apareciendo más y más detallada, hasta llegar a esas fantásticas pantallas 4k, tan de moda últimamente, e incluso más allá: se nos revelarán los detalles más pequeños del objeto.

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El tamaño del píxel funciona como la longitud de onda en microscopia: cuanto más pequeño, con más detalle se ve la imagen

En el caso de la luz visible, las longitudes de onda varían más o menos entre 400 y 700 nanómetros (un nanómetro es la milmillonésima parte de un metro), por lo cual este tipo de microscopia nos permite ver en detalle estructuras micrométricas, como células o bacterias. Llevando la resolución al límite (lo que se conoce como límite de difracción), pueden distinguirse estructuras de unos 200 nm, pero no menores. La mayoría de los virus tienen menor tamaño, y los orgánulos celulares y biomoléculas (proteínas, ácidos nucleicos) son aún menores. ¿Cómo podemos “verlos”, entonces? La lógica nos dice que necesitamos menores longitudes de onda.

Los rayos X tienen una longitud de onda entre 0,01 y 10 nm, o sea, entre 50 y 5000 veces menor que la luz visible, aproximadamente. Esto nos permitiría, en teoría, resolver detalles de tamaño atómico. ¿Es esta la solución que buscábamos? Bueno, solo en parte. Los rayos X son mucho más “energéticos” que los de luz visible, como ya tuvimos ocasión de comentar en otro post. Por ello, las muestras biológicas pueden resultar dañadas durante el proceso de observación. Sin embargo, sí que es posible utilizar los rayos X para la observación de estructuras del tamaño de biomoléculas con resolución atómica, utilizando la técnica de difracción de rayos X, en la cual, la estructura se “reconstruye” a partir de cómo los rayos X son desviados por los átomos de la muestra situados en una red cristalina. La regularidad de la red facilita la reconstrucción de la imagen. Sin embargo, esta técnica tiene dos inconvenientes: 1) se necesita que la muestra esté en forma cristalina, cosa que no siempre es fácil de conseguir, y 2) La estructura de la biomolécula en el cristal puede no ser la misma que tiene en condiciones fisiológicas, donde está disuelta en una solución acuosa.

DNAasa

Imagen de un cristal de ADNasa y estructura molecular de la misma, obtenida por difracción de rayos X

Y llegamos por fin a los electrones. Desde la ecuación que estableció De Broglie, basada en la dualidad onda-partícula, sabemos que se puede asociar a toda partícula una longitud de onda equivalente. En un microscopio electrónico, los electrones se usan como “luz” de una longitud de onda asociada muy pequeña. Dicha longitud de onda depende de la energía que adquieran dichos electrones al ser acelerados por un potencial eléctrico, y varía habitualmente entre 0,002 y 0,015 nm, es decir, que nos permiten apreciar más detalles que los rayos X, al menos en teoría.

Pero aquí nos topamos de nuevo con dos inconvenientes importantes, a la hora de obtener imágenes de biomoléculas o estructuras biológicas. Una ya la conocemos: si los electrones llevan una gran energía, impactan en la muestra y la pueden dañar. Como ejemplo, baste ver cómo electrones acelerados a “solo” 3000 V son capaces de dejar la superficie de una muestra sólida como un auténtico colador:

SEM

Orificios producidos por electrones acelerados por un potencial de 3000 V en una muestra de ioduro de trietilamonio. Imagen de microscopia electrónica de barrido (SEM)

El segundo inconveniente es que los electrones no deben toparse con nada entre su fuente y la muestra, para no ser desviados de su trayectoria, por lo que los microscopios electrónicos trabajan en un altísimo vacío. El vacío extremo es capaz también de deformar las muestras biológicas, principalmente por deshidratación, de modo que la imagen que obtendríamos no es acorde con la que realmente tendría la muestra en condiciones biológicas. Para entenderlo, baste comparar tomate deshidratados al vacío con otros al natural:

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Efecto de la deshidratación en los tomates

¿PUEDE EL FRÍO SOLUCIONAR ESTOS PROBLEMAS?

Una posible solución para evitar la deshidratación en el vacío y, de paso, proteger a la muestra parcialmente de los impactos de los electrones de alta energía es congelar la muestra. Sin embargo, una congelación normal del agua causa otro tipo de daños a las muestras biológicas. El agua, al congelarse, forma cristales de hielo (si no, no tendríamos esas bonitas formas regulares de los copos de nieve). Estos cristales microscópicos pueden destruir en parte la estructura de la muestra. Pensemos, por ejemplo, en cómo algunos alimentos pierden su textura natural al congelarlos. O en las dificultades de guardar tejidos biológicos en buen estado mediante congelación (óvulos, esperma, embriones, Walt Disney…). ¿Existe alguna forma de solidificar el agua sin que se formen esos peligrosos cristales de hielo? Pues resulta que sí que la hay, aunque no es sencillo.

Si el agua se enfría lentamente, como cuando metemos la bandeja de cubitos en el congelador de casa, las moléculas tienen tiempo de reorganizarse y adoptar la estructura ordenada que tienen en los cristales de hielo. Pero si el enfriamiento es muy rápido y a muy baja temperatura (entre –185 y –195 ºC), las moléculas se quedan inmovilizadas de golpe en la misma posición que ocupaban en estado líquido, mucho menos ordenada. Al estar inmóviles, el resultado es también un sólido, pero desordenado (amorfo). Esto es lo que se conoce como un vidrio, y el proceso de enfriado que conduce a este estado, como vitrificación. Una ventaja adicional de este procedimiento es que la muestra se queda en la misma situación que tenía en solución acuosa, lo cual es justo lo que nos interesa estudiar en el caso de las biomoléculas.

En 1984, Dubochet describió el proceso de vitrificación de las muestras y posterior análisis de las mismas por microscopia electrónica. En ese momento, el objetivo era que la muestra estuviera en su situación en solución y protegida del daño de los electrones de alta energía por las bajísimas temperaturas a las que se realizaban los experimento. Frank y Henderson desarrollaron métodos para poder analizar los datos tomados de muchas estructuras presentes en la misma muestra, analizándolos posteriormente para reconstruir la estructura con detalle, e incluso en 3D. Además, tomar datos de muchas estructuras permite que cada una de ellas sea bombardeada con un haz menos intenso de electrones, lo cual redunda en su estabilidad.

En la actualidad, con la ayuda de software y ordenadores, la técnica se ha sofisticado de forma que permite tomar cientos o miles de imágenes de biomoléculas de la muestra y combinarlas en una, con información 3D a resolución atómica. Actualmente, se obtienen imágenes con una resolución de 2 Angstrøm (0,2 nm), comparables a las de difracción de rayos X, solo que, en las primeras, la estructura que se ve es la misma que la que tiene la biomolécula en el ser vivo, por lo que proporciona información más valiosa. Resulta instructivo ver cómo ha mejorado la resolución de las imágenes con el tiempo:

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Imagen compuesta del enzima beta-galactosidasa, donde se aprecia cómo ha ido aumentando la resolución conforme ha mejorado la técnica de criomicroscopia electrónica

Y TODA ESTA INFORMACIÓN, ¿PARA QUÉ SIRVE?

Pues, por ejemplo, para estudiar virus a resolución atómica y “ver” todo el detalle de su superficie, relacionada con su capacidad de infección, o para el estudio de la arquitectura de las células, visualizando con detalle las “máquinas” que producen proteínas, los ribosomas, o la estructura que protege el ADN, la cromatina, relacionada con los mecanismos epigenéticos, pero también para el estudio de materiales, tales como nanopartículas o polímeros. En suma, para tener una imagen mucho más detallada de lo que ocurre en los niveles de tamaño molecular y atómico, que es donde, a la postre, sucede todo lo importante. El mundo que nos rodea es una consecuencia de esos procesos, incluyéndonos a nosotros mismos. Nuestra curiosidad y la ciencia que hemos desarrollado hacen posible que veamos mucho más allá de lo que nuestros ojos nos permiten, y comprendamos mucho mejor lo que somos. ¿No merecía esto acaso un premio Nobel?

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Imagen de un virus con resolución atómica

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Acerca de isqch

El Instituto de Síntesis Química y Catálisis Homogénea (ISQCH) es un instituto de investigación química mixto entre el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) y la Universidad de Zaragoza.

3 comentarios el “Nobel de Química de 2017: Criomicroscopia electrónica

  1. Fernando
    15/10/2017

    Como siempre, José Ignacio, ha iluminado un tema con la longitud de onda precisa para dejarlo meridianamente claro… con altísima resolución. Excepcional post!
    Fernando

  2. Camilo Buitrago
    17/10/2017

    Hola, soy Químico Farmacéutico seguidor de esta página, su contenido es muy divertido y científico y los post que publican son realmente buenos. Que bueno que no han olvidado la página, ya que hace mucho no publicaban algo, y me gusta mucho porque muestran la química pura y aplicada de una forma muy práctica y fácil de entender, a pesar de que muchos de estos temas pueden ser muy complejos. Por un lado felicitarlos, porque esta página y sus publicaciones son del agrado de muchas personas. Por otro lado, este artículo me genera una gran duda y es, ¿cuál es la longitud de onda más pequeña que podría usarse en microscopía? Revisando en internet, encontré que la longitud de onda de Planck es la que se supone es la más pequeña y que equivale a 1,6 x 10 elevado a -35 metros. Teniendo en cuenta que el tamaño estimado de un átomo es del orden de 10 elevado a -14 metros, ¿podríamos llegar un día a acercarnos tanto como para ver una molécula pequeña de frente? ¿qué tan fácil puede ser conseguir una longitud de onda así de pequeña y como manipularla para “ver” moléculas o inclusive (siendo osado) átomos? Por lo que sabemos, los átomos no son cuerpos macizos y hay una nube electrónica, ¿Cómo se verían entonces? Me despierta muchísima curiosidad acercarnos así a tanta información del universo.

    Gracias por construir esta maravillosa página.

    Saludos desde Bogotá, Colombia.

    • isqch
      18/10/2017

      Gracias, Camilo, por tus positivos comentarios. Nos gustaría que la página fuera más dinámica y actualizara contenidos cada poco tiempo, pero hacemos lo que podemos, con el poco tiempo disponible. Comentarios como el tuyo nos animan a redoblar esfuerzos.
      En cuanto a lo que comentas acerca de obtener imágenes con mayor resolución, lo cierto es que ya se ha conseguido, con la ayuda de otras técnicas. Por ejemplo, la microscopia de efecto túnel (STM en sus siglas en inglés), desarrollada por ingenieros de IBM en Zurich en 1981, ha permitido obtener imágenes de átomos individuales. Tiene una resolución de 1 Angstrom de anchura y 0,1 Angstrom de profundidad. Por cierto, sus desarrolladores recibieron también el Premio Nobel, esta vez de Física. Esta microscopia se basa en efectos cuánticos, concretamente el llamado “efecto tunel”, por el que una partícula (en este caso un electrón) puede aparentemente atravesar una barrera de energía potencial sin tener energía cinética suficiente para pasar por encima. Esto genera una peqeñísima corriente eléctrica, que sirve para reconstruir la imagen de la superficie estudiada. Utilizando esta técnica, se han realizado “hazañas” como escribir las letras IBM con átomos de Xenón individuales colocados sobre una superficie metálica (https://en.wikipedia.org/wiki/IBM_(atoms)), o incluso realizar una película de animación (https://youtu.be/oSCX78-8-q0). Sin embargo, esta técnica es difícilmente aplicable a muestras biológicas como las que se estudian con la criomicroscopia electrónica (CME). Otra técnica con resolución se 1 Angstrom es la difracción de neutrones. Siguiento la ecuación de De Broglie, la longitud de onda asociada de un neutron es todavía menor que la de un electrón, por lo que las técnicas de difracción permiten determinar con gran precisión la posición de átomos individuales. De nuevo, esta técnica es difícilmente aplicable al tipo de muestras biológicas que se estudian con la CME. Para generar los neutrones necesarios se precisa de un reactor nuclear o un acelerador de partículas, algo poco práctico para una aplicación general.
      Para terminar, hay que tener en cuenta siempre el dilema de que a menor longitud de onda, mayor energía. En el caso de la radiación electromagnética (fotones), esto implica una mayor tasa de daño en la muestra durante el proceso de medida. Más allá de los rayos X tenemos los rayos gamma, generados en los procesos radioactivos, cuyo peligro ya conocemos. En el caso de partículas como los electrones, una menor longitud de onda asociada podría conseguirse aplicando un mayor potencial, de varios cientos de miles de voltios. De nuevo, esto fácilmente dañaría la muestra, sobre todo si se trata de estructuras tan frágiles como las de las proteínas o el ADN.
      Saludos y gracias por seguirnos.

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